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PCD-007 光化學柱后衍生器
——提高黃曲霉毒素檢測靈敏度和重復性的利器
成都摩爾科學儀器有限公司
目錄
1 黃曲霉毒素的危害 ........................................................................................................................ 1
2 黃曲霉毒素的檢測方法 ................................................................................................................ 1
3 黃曲霉毒素檢測所需試劑及耗材 ............................................................................................... 2
4 艾力析實驗科技有限公司研制的光化學柱后衍生器 ................................................................ 3
4.1 儀器介紹 ........................................................................................................................... 3
4.2 產品特點 ........................................................................................................................... 4
4.3 產品參數 ........................................................................................................................... 4
4.4 安裝使用 ........................................................................................................................... 4
4.5 常見故障及簡易排除方法 ................................................................................................ 4
4.6 注意事項及日常維護 ....................................................................................................... 5
4.7 黃曲霉毒素檢測的解決方案 ............................................................................................ 5
4.7.1 營養米粉類嬰幼兒輔食 ........................................................................................ 5
4.7.2 乳制品 ................................................................................................................... 7
4.7.3 糧油 ........................................................................................................................ 9
4.7.4 花生及其制品 ..................................................................................................... 11
4.7.5 飼料 ..................................................................................................................... 13
4.7.6 中藥材 ................................................................................................................. 15
4.8 磺胺類藥物的檢測 .......................................................................................................... 17
4.9 其他應用 ......................................................................................................................... 18
1 黃曲霉毒素的危害
黃曲霉毒素是一組化學結構類似的二呋喃香豆素的衍生化合物，可以由曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽滯曲霉產生。黃曲霉毒素常常存在于發生霉變的中藥材、谷物、農作物、堅果、奶制品以及動物飼料中等相關的產品中。其中 B1、B2、G1、G2易污染多種農作物、食品、飼料及中藥材。黃曲霉毒素被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究結構（IARC）劃定為 I 類致癌物，是一種毒性極強的物質，其毒性是氰化鉀的 10 倍，其中以 B1毒性zui大。當人攝入量大時，可發生急性中毒，出現急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生。當微量持續攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。
2 黃曲霉毒素的檢測方法
黃曲霉毒素是當前食品及藥品中污染zui嚴重的真菌毒素之一。因此，GB/T 2761-2011嚴格規定了各類食品中的限量，zui低限量值是 0.5μg/kg,所建立的檢測方法必須達到 0.05μg/kg 的zui低定量限才能滿足限量的檢測。同時在 2015 版藥典七大變化之一安全性控制項
目大幅提升中，明確規定并強制推行中藥材中黃曲霉毒素的限量檢測。對《中國藥典》收載的柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎等 14 味藥材及其飲品品種項下增加“黃曲霉毒素”檢查項目，限度為“黃曲霉毒素 B1不得超過 5μg/kg;黃曲霉毒素 B2、黃曲霉毒素 G1、黃曲霉毒素 G2總量不得超過10μg/kg”。目前，對食品和中藥材中黃曲霉毒素的檢測方法主要有：薄層色譜法（TLC），酶聯免疫吸附法（ELISA）,親和層析法（AFTB1）、免疫親和-液相色譜法（HPLC 法）及液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）。其中將免疫親和柱與高效液相色譜法結合應用，由于其前處理方法簡單、儀器使用成本相對較低、可異構體分離、分離靈敏度高、穩定性好等******性，近年來已經得到廣泛的應用。由于黃曲霉毒素 B1、G1采用液相色譜熒光檢測直接檢測時易發生猝滅而導致靈敏度較低，因此需要對其進行衍生后才能達到痕量檢測的要求。現行的黃曲霉素檢測采用的衍生方法主要分為柱前衍生（TFA 柱前衍生）和柱后衍生法（光化學柱后衍生、溴和碘柱后衍生）。采用 TFA 柱前衍生法，雖然檢測靈敏度高，但需要用到有毒有害試劑（三氟乙酸、正己烷），且操作較其他幾種方法繁瑣；溴和碘柱后衍生法，在
樣品預處理上相對較簡單，但檢測時需配備傳統的柱后衍生裝置，同時需要手動品配制衍生液，而不同人手動配制的衍生液的濃度會存在差異，從而導致待測物質保留時間穩定性較差。而光化學柱后衍生法在操作上相對簡單，樣品經過處理后可直接進樣分析，減少了有機試劑的接觸；且有效提高黃曲霉毒素檢驗靈敏度和重復性;此外光化學柱后衍生器較傳統的柱后衍生裝置成本低，且檢測靈敏度較溴和碘柱后衍生法理想。
4.2 產品特點
（1）無需使用化學物質（節約成本的同時，也避免操作人員接觸有毒化學物質）；
（2）較傳統柱后衍生裝置（化學衍生泵、混合器、溫控裝置）成本低；
（3）直接連接于色譜柱與熒光檢測器之間，安裝操作簡單；
（4）外觀設計精巧細致，節省實驗室空間；
（5）******采用進口配件，******了產品的使用性能；
（6）采用 PHILIP 進口紫外燈光源，使用壽命長達 8000h；
（7）采用專利的支架和管線纏繞方式，******了反應效率；
（8）可與國內外各種品牌及型號的熒光檢測器聯用；
（9）無腐蝕性酸流經毛細管，增加 HPLC 儀器的壽命；
（10）可持續工作數千小時，用后無需沖洗步驟；
（11）黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 的zui低檢測限均小于 0.5 ppb；
（12）符合 AOAC 2005.08, AOAC 2008.02,AOCS Aa 11-05 ，中國臺灣標準（食
字 0981800370 號公告）和歐盟藥典 2.8.18 標準分析方法要求；
（13）符合中國國家標準和進出口檢驗標準及 2015 版中國藥典要求（增訂光化學衍生法）；
4.3 產品參數
設備尺寸：411mm×53mm×68mm（長×寬×高）
凈重： kg
毛重： kg
管線有效長度：25m
出入端管線長度：≤500mm
紫外燈壽命：≥4000
工作電源：220V、50Hz
工作功率：11W
環境溫度：0~45℃
環境要求：嚴禁浸水、淋水，內含易碎物質避免沖擊及跌落。
4.4 安裝使用
（1）將衍生器上的聚四氟乙烯管，用配套規格的的 PEEK 接頭，一端連接色譜柱，一段連接檢測器，無連接方向要求
（2） 啟動 HPLC 恒流輸液泵并且流量壓力均穩定后，檢測各連接器件有無漏液情況，確定無誤通電并打開電源開關（正面綠色自鎖開關），系統進入紫外燈管預熱狀態。此時紫外燈點亮并預熱，大約 10min 光線穩定后即可正常衍生反應。
4.5 常見故障及簡易排除方法
（1）儀器安裝完畢后，務必開啟高壓泵經過 1~2min 恒壓運行，用濾紙檢查儀器前后連接件確定無漏液后再開啟電源使用，漏液應及時清潔，避免流動相溶劑對設備的腐蝕。避免環境影響，縮短平衡時間。
（2）請匆自行拆開儀器或任意改變溫度控制器的內部設置，普通用戶對于復雜的系統參數設置不熟悉時盡量使用出廠默認值或儀器自動設定值，如有問題請及時與本公司聯系。
（3）儀器通電衍生后，出峰變小或異常峰；燈管光照不足或燒壞，使用備用系統或返廠更換維修；上述問題您無法解決時，請與經銷商或廠家聯系。
4.6 注意事項及日常維護
（1）使用前請檢查電源插座是否良好接地，若沒有請用線接好背面保護地線！柱大量漏液時可能對電氣有腐蝕作用，長期腐蝕可能引起漏電，造成事故損失，因此請確保儀器良好接地。
（2）應保持柱箱部件的清潔，不用時請切斷電源。
（3）嚴禁非維修人員拆解儀器，內有紫外光線，請勿直視漏光部位。
（4）燈管為專用燈管，更換時請務必確認切斷電源。
（5）儀器自然散熱，工作中請******通風，勿覆蓋影響散熱。
4.7 黃曲霉毒素檢測的解決方案
4.7.1 營養米粉類嬰幼兒輔食
嬰幼兒正直身體發育時期，應該營養均衡搭配，提倡給嬰幼兒吃大自然提供給人類的各種食物。而在這些食物中，嬰幼兒米粉（稱“嬰幼兒配方谷粉”、“營養米粉”或“嬰幼兒米糊”），是母乳或嬰兒配方食品不能滿足嬰兒營養需要以及嬰兒斷奶期間時，為補充嬰幼兒營養的非常重要的輔助食品。由于營養米粉以小米、大米為主要原料，而小米和大米若儲藏不當，******容易受到黃曲霉毒素的污染。據不******統計，2015 年以來，國家食藥監總局共公布了 64 批次存在食品安全風險的嬰幼兒輔食，其中黃曲霉毒素等污染物超標達 15
批次。因此，企業和國家質檢部門有必要加強對嬰幼兒輔食中霉菌毒素的檢測與監管，保障嬰幼兒食品的安全。
針對嬰幼兒營養米粉中黃曲霉毒素 B1 的檢測，青島艾力析實驗科技有限公司為您提供了整套解決方案。滿足我國嬰幼兒食品中黃曲霉毒素 B1(GB2761-2011)的限量標準 0.5μg／kg 的要求。
（1）色譜條件
色譜柱：Sepax Sapphire C18 5um 4.6*300mm(PN:320185-4630)
流動相：甲醇—水 （55/45，v/v）
柱溫：25℃
流速：0.8mL/min
進樣量：20μL
檢測器：熒光檢測器
檢測波長：EX（激發波長）=360nm,EM（發射波長）=420nm
進樣前2min開啟光化學衍生池電源
光化學衍生化系統：光化學衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）
（2）樣品處理
? 提取
? ******稱取 25.000g 樣品于 500mL 的具塞玻璃容量瓶中，加入 125mL 甲醇-水(體積比為 70∶30)溶液；
? 在高速勻質機上勻質 2～3min；
? 取 30mL 左右勻質后的樣液以 4000r／min 離心 5min；
? 取上層清液 10mL 加入 30mL 水稀釋，搖勻后過玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。
? SPE 柱凈化
? 回溫解凍：提前辦小時將黃曲霉毒素免疫親和柱從冰箱拿出常溫解凍；
? 安裝：將回溫解凍后的免疫親和柱安裝到固相萃取裝置上；
? 上樣：將提取的樣品濾液全部轉移到 10mL 玻璃注射器中，調節固相萃取裝置上的壓力控制閥，控制樣品溶液以 1 滴/s 的速度通過免疫親和柱，直至 2~3mL 空氣通過柱體，棄去流出液；
? 淋洗：向玻璃注射器內加入 10mL 水淋洗免疫親和柱，流速位 1 滴/s~2 滴/s，淋洗液兩次。直至空氣進入免疫親和柱后有 2~3mL 空氣通過柱體，棄去全部的流出液，抽干小柱；
? 洗脫：******加入2.0mL流動相至注射器內，以約為1滴/s的流速將免疫親和柱上的B1洗脫下來,收集全部的洗脫液于干凈的玻璃離心管中,于渦旋混合器上振蕩1min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
（3）樣品測定
HPLC 直接進樣，經 C18 色譜柱、光化學柱后衍生化后熒光檢測器直接記錄并計算出黃曲霉毒素 B1 的濃度；圖 3 為嬰幼兒營養米粉中黃曲霉毒素 B1 樣品檢測及加標樣品檢測疊加譜圖。
（1）色譜條件
色譜柱：Sepax Sapphire C18 5um 4.6*300mm(PN:320185-4630)
流動相：甲醇—乙腈—水 （25/20/55，v/v）
柱溫：30℃
流速：1.0 mL/min
進樣量：20μL
檢測器：熒光檢測器
檢測波長：EX（激發波長）=355nm,EM（發射波長）=430nm
進樣前2min開啟光化學衍生池電源
光化學衍生化系統：光化學衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）
（2）樣品處理
? 提取
? ******稱取 2.0000g 奶粉樣品，置于 50mL 的離心管中。將 20mL 已預熱到 50℃的水加入到奶粉中，邊加邊振搖至奶粉******溶解；
? 在渦旋混合器上振蕩 2min 混合均勻；
? 將奶粉乳濁液冷卻至室溫后，于 10000r/min、在-5℃下離心 10min；
? 取 30mL 左右勻質后的樣液以 4000r／min 離心 5min；
? 將樣品溶液用玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。
? SPE 柱凈化
? 回溫解凍：提前辦小時將黃曲霉毒素免疫親和柱從冰箱拿出常溫解凍；
? 安裝：將回溫解凍后的免疫親和柱安裝到固相萃取裝置上；
? 上樣：將提取的樣品濾液全部轉移到 10mL 玻璃注射器中，調節固相萃取裝置上的壓力控制閥，控制樣品溶液以 1 滴/s 的速度通過免疫親和柱，直至 2~3mL 空氣通過柱體，棄去流出液；
? 淋洗：向玻璃注射器內加入 10mL 水淋洗免疫親和柱，流速位 1 滴/s~2 滴/s，淋洗液兩次。直至空氣進入免疫親和柱后有 2~3mL 空氣通過柱體，棄去全部的流出液，抽干小柱；
? 洗脫：******加入1.0mL流動相至注射器內，以約為1滴/s的流速將免疫親和柱上的B1洗脫下來,收集全部的洗脫液于干凈的玻璃離心管中,用水定容到2mL。于渦旋混合器上振蕩1min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
（3）樣品測定
HPLC 直接進樣，經 C18 色譜柱、光化學柱后衍生化后熒光檢測器直接記錄并計算出黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1 和 M2 的濃度；圖 4 為 6 種黃曲霉毒素同時檢測的色譜圖。
（1）色譜條件
色譜柱： Sepax Sapphire C18 5um 4.6*300mm(PN:320185-4630)
流動相：甲醇—水 （50/50，v/v）
柱溫：30℃
流速：1.0 mL/min
進樣量：20μL
檢測器：熒光檢測器
檢測波長：EX（激發波長）=360nm,EM（發射波長）=440nm
進樣前2min開啟光化學衍生池電源
光化學衍生化系統：光化學衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）
（2）樣品處理
? 提取
? ******稱取 25.000g 糧、油樣品于 500mL 錐形瓶中，加入 5g 氯化鈉、加入 125mL甲醇水(體積比為 70∶30)；
? 在高速勻質機上勻 20mL 水稀釋，搖勻后過玻璃纖維濾紙過濾，濾液備用。
? SPE 柱凈化
? 回溫解凍：提前辦小時將黃曲霉毒素免疫親和柱從冰箱拿出常溫解凍；
? 安裝：將回溫解凍后的免疫親和柱安裝到固相萃取裝置上；
? 上樣：將提取的樣品濾液全部轉移到 10mL 玻璃注射器中，調節固相萃取裝置上的壓力控制閥，控制樣品溶液以 1 滴/s 的速度通過免疫親和柱，直至 2~3mL 空氣通過柱體，棄去流出液；
? 淋洗：向玻璃注射器內加入 10mL 水淋洗免疫親和柱，流速位 1 滴/s~2 滴/s，淋洗液兩次。直至空氣進入免疫親和柱后有 2~3mL 空氣通過柱體，棄去全部的流出液，抽干小柱；
? 洗脫：******加入1.0mL甲醇至注射器內，以約為1滴/s的流速將免疫親和柱上的B1洗脫下來,收集全部的洗脫液于干凈的玻璃離心管中,加入1.0mL純水于洗脫液中，于渦旋混合器上振蕩1min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
（3）樣品測定
HPLC 直接進樣，經 C18 色譜柱、光化學柱后衍生化后熒光檢測器直接記錄并計算出黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的濃度；圖 4 為各樣品檢測色譜圖。
（1）色譜條件
色譜柱：Sepax Sapphire C18 5um 4.6*300mm(PN:320185-4630)
流動相：甲醇—水 （55/45，v/v）
柱溫：25℃
流速：0.8mL/min
進樣量：50μL
檢測器：熒光檢測器
檢測波長：EX（激發波長）=360nm,EM（發射波長）=420nm
進樣前2min開啟光化學衍生池電源
光化學衍生化系統：光化學衍生器（連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器）
（2）樣品處理
? 提取
? ******稱取 25.000g 粉碎樣品于 500mL 的錐形瓶中，加入 125mL 甲醇-水(體積比
為 70∶30)溶液；
? 在高速勻質機上勻質 2～3min；
? 取 30mL 左右勻質后的樣液以 4000r／min 離心 10min；
? 用槽紋濾紙過濾試樣溶液于 50mL 量筒中；
? 收集濾液 15mL，加入 30mL 二次去離子水，混勻，將稀釋后的濾液用玻璃纖維濾紙再次過濾。
? SPE 柱凈化
? 回溫解凍：提前辦小時將黃曲霉毒素免疫親和柱從冰箱拿出常溫解凍；
? 安裝：將回溫解凍后的免疫親和柱安裝到固相萃取裝置上；
? 上樣：將提取的樣品濾液 15mL 轉移到玻璃注射器中，調節固相萃取裝置上的壓力控制閥，控制樣品溶液以 1 滴/s 的速度通過免疫親和柱，直至 2~3mL 空氣通過柱體，棄去流出液；
? 淋洗：向玻璃注射器內加入 10mL 去離子水淋洗免疫親和柱，流速位 1 滴/s~2滴/s，淋洗液兩次。直至空氣進入免疫親和柱后有 2~3mL 空氣通過柱體，棄去全部的流出液，抽干小柱；
? 洗脫：加入1.0mL甲醇至注射器內，以約為1滴/s的流速將免疫親和柱上的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2洗脫下來,收集全部的洗脫液于干凈的玻璃離心管中,并加入1mL去離子水，于渦旋混合器上振蕩1min，過0.45μm濾膜，供液相色譜測定。
（3）樣品測定
HPLC 直接進樣，經 C18 色譜柱、光化學柱后衍生化后熒光檢測器直接記錄并計算出黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的濃度；圖 6 為花生粉樣品添加 1.5μg/kg 水平的色譜圖。
根據 GB/T 30955-2014 中飼料中黃曲霉毒素的檢測方法，青島艾力析實驗科技有限公司提供完整的解決方案。
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